PCR para el reordenamiento de receptores de antígeno (PARR) como herramienta complementaria para diferenciar entre linfoma gastrointestinal y enfermedad inflamatoria intestinal en un gato: reporte de un caso

MVZ Dipl. Brenda Gómez

Clínica veterinaria de alta especialidad en oncología y enfermedades genéticas Oncogenes, Ciudad de México

Asesor:

Maestro en ciencias MC MVZ Benedict López

Resumen

La diferenciación entre enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y linfoma intestinal de bajo grado en felinos representa un desafío diagnóstico debido a la similitud de sus manifestaciones clínicas, hallazgos ultrasonográficos e incluso de sus resultados histopatológicos. Se presenta el caso de una gata esterilizada de 8 años de edad con antecedentes de pérdida de peso, hiporexia, diarrea y vómito intermitente. El estudio ultrasonográfico reveló engrosamiento de la pared intestinal y linfonodos mesentéricos aumentados de tamaño, hallazgos compatibles con EII o linfoma intestinal. Se realizaron biopsias intestinales obtenidas por endoscopia, cuyo análisis histopatológico reportó una probable enteritis linfoplasmocitaria severa con proliferación linfoide, sin descartar linfoma intestinal de bajo grado. Debido a la naturaleza no concluyente de los hallazgos histopatológicos, se empleó la técnica de PCR para el reordenamiento de receptores de antígeno (PARR) con el objetivo de evaluar la clonalidad de la población linfoide. El resultado fue negativo para reordenamiento clonal, lo que apoyó el diagnóstico de enfermedad inflamatoria intestinal y permitió descartar la presencia de una neoplasia linfoide en el momento del estudio. Este caso resalta la utilidad de la prueba PARR como herramienta complementaria para el diagnóstico diferencial entre procesos inflamatorios y neoplásicos del tracto gastrointestinal felino, especialmente en aquellos en los que los métodos diagnósticos convencionales resultan insuficientes.

Palabras clave: enfermedad inflamatoria intestinal, linfoma intestinal, PCR PARR, clonalidad

Abstract

Differentiating feline inflammatory bowel disease (IBD) from low-grade intestinal lymphoma remains a diagnostic challenge because of the overlap in clinical signs, ultrasonographic findings, and even histopathologic features. This report describes the case of an eight-year-old spayed female cat that presented with weight loss, hyporexia, diarrhea, and intermittent vomiting. Abdominal ultrasonography revealed intestinal wall thickening and enlarged mesenteric lymph nodes, findings compatible with either IBD or intestinal lymphoma. Endoscopic intestinal biopsies were obtained, and histopathologic examination revealed severe lymphoplasmacytic enteritis with lymphoid proliferation; however, low-grade intestinal lymphoma could not be excluded. Because the histopathologic findings were inconclusive, polymerase chain reaction for antigen receptor rearrangement (PARR) was performed to assess lymphoid clonality. The test result was negative for clonal rearrangement, supporting a diagnosis of inflammatory bowel disease and arguing against lymphoid neoplasia at the time of testing. This case highlights the value of PARR as a complementary diagnostic tool for distinguishing inflammatory from neoplastic gastrointestinal disease in cats, particularly when conventional diagnostic methods fail to provide a definitive diagnosis.

Keywords: inflammatory bowel disease, intestinal lymphoma, PCR PARR, clonality

Introducción

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) en gatos es una afección crónica que se caracteriza por cambios en la mucosa gastrointestinal, anomalías de la arquitectura celular e infiltrado inflamatorio. En la mayoría de los casos, se observan linfocitos y células plasmáticas. Su etiología se asocia con alteraciones genéticas de la metagenómica del aparato digestivo. Los signos clínicos más frecuentes incluyen distensión abdominal, anorexia, vómito recurrente y diarrea, que puede presentarse de forma intermitente o persistente.

El diagnóstico suele basarse en estudios de laboratorio e imagen, como radiografías y ecografía abdominal. Aunque actualmente también se emplean métodos como la endoscopia con biopsia y la toma de biopsia directa como “prueba de referencia”, las muestras superficiales de menor tamaño no son óptimas para detectar infiltrado. El tratamiento se realiza habitualmente mediante la modificación de la alimentación y la administración de fármacos antiinflamatorios.1

Por otro lado, el linfoma gastrointestinal, o linfosarcoma, en gatos es un tumor maligno de origen linfocitario que puede producir lesiones en cualquier parte del tracto gastrointestinal. Los signos clínicos suelen ser distensión abdominal, vómito, diarrea, anorexia y pérdida de peso. El diagnóstico se realiza mediante un estudio de histopatología obtenida preferentemente por endoscopia. El pronóstico puede variar dependiendo del fenotipo celular, ya que el linfoma de células T suele ser menos sensible al tratamiento con quimioterapia que el de células B.2

En la práctica médica, distinguir entre una proliferación inflamatoria reactiva y una neoplasia linfoide puede resultar complejo, especialmente cuando los hallazgos citológicos e histopatológicos son ambiguos, lo que puede repercutir en la toma de decisiones y el manejo terapéutico. En este contexto, la incorporación de técnicas moleculares como PCR para reordenamiento de receptores de antígeno (PARR) ha surgido como una herramienta útil y precisa para diferenciar entre ambos procesos.

La PCR es el proceso de amplificación de un segmento específico de ADN para su posterior análisis. El resultado de esta amplificación puede analizarse de diversas maneras. En el caso de los procesos linfoproliferativos, el ADN puede separarse por tamaño para buscar poblaciones clonales de células B y T.3

En un individuo, cuando existe una respuesta inmunitaria normal a un agente patógeno, las células se activan, el núcleo y el citoplasma aumentan de tamaño y, posteriormente, mueren, dejando células de memoria residuales.3,4 Por otra parte, cuando la célula se vuelve neoplásica, deja de responder a los controles del crecimiento, lo que provoca una expansión ilimitada.

Bases genéticas

La capacidad del sistema inmunitario para reconocer antígenos depende de mecanismos genéticos altamente especializados. A diferencia de otras células del organismo, los linfocitos sufren modificaciones dirigidas en su ADN durante su desarrollo, lo que permite la generación de receptores antigénicos únicos.

Los linfocitos B expresan inmunoglobulinas (Ig), mientras que los linfocitos T expresan receptores de células T (TCR). Los genes que codifican estas moléculas están organizados en múltiples segmentos génicos separados denominados segmentos variables (V), diversidad (D) y joining (J).

Durante la maduración linfocitaria ocurre un proceso denominado recombinación somática V(D)J, mediante el cual distintos segmentos génicos se recombinan aleatoriamente para formar un gen funcional único. V+D+J→VDJ.3-6

Cuando los genes de los receptores de las inmunoglobulinas y de las células T se reorganizan, la longitud y la secuencia del gen resultan diferentes entre una célula y otra; esto se debe a que pueden añadirse nucleótidos entre los segmentos V, D y J a medida que se reorganizan. Los ensayos de clonalidad aprovechan esta característica.

En un proceso inflamatorio reactivo, se encuentran múltiples genes de células T e inmunoglobulinas de diferentes tamaños, mientras que en una muestra compuesta por células neoplásicas, los genes de las inmunoglobulinas o el del receptor de las células T tendrán el mismo tamaño (fig. 1).1

Figura 1. A. Reordenamiento de los genes de las inmunoglobulinas: los genes VDJ se juntan al azar para crear un único segmento que codifica la parte de unión al antígeno; como resultado, cada una de las células B debería tener un segmento del gen VDJ con una longitud única . B, Cuando una población está formada por células derivadas de un único clon, todos los segmentos serán idénticos.

Caso clínico

Se presenta el reporte de un caso clínico de un felino con problemas digestivos crónicos, implementando la técnica PARR como herramienta complementaria para diferenciar entre enfermedad inflamatoria intestinal y linfoma intestinal.

Ari, felino, hembra esterilizada, al momento de la consulta tenía 8 años de edad (fig. 2). Acudió a consulta por presentar pérdida de peso, hiporexia, diarrea y vómito intermitente. En la auscultación abdominal se reportaron ruidos intestinales aumentados. Durante la palpación abdominal, presentó abdomen distendido y linfonodos periféricos sin alteraciones aparentes al momento de la consulta.

Figura 2. Foto de la paciente, Ari.

Abordaje

Se realizó ultrasonido abdominal, en el que se detectó engrosamiento de la pared intestinal en la región de las asas intestinales, con la capa muscular más engrosada que la mucosa, así como linfonodos mesentéricos aumentados de tamaño. Estos hallazgos son sugestivos de enfermedad intestinal inflamatoria o de linfoma intestinal. Debido a las alteraciones encontradas en el ultrasonido, se realizaron endoscopia y biopsia intestinales.

Materiales y métodos

  • Ultrasonografía abdominal. Se revisó el reporte de ultrasonido abdominal previamente realizado por el imagenólogo.
  • Método de histopatología. Se obtuvo una muestra de tejido de duodeno y yeyuno mediante endoscopia y se preservó en formol al 10% para su procesamiento. Se envió al citotecnólogo para el manejo, la tinción y el corte del tejido y, posteriormente, al área de patología para su análisis.
  • Análisis molecular. Se obtuvo una muestra de sangre completa, la cual fue colectada de sangre periférica (vena cefálica) y preservada en tubos con EDTA para su posterior procesamiento. Para la extracción de ácidos nucleicos, se utilizó el kit de extracción Quick- ADNTM Miniprep Plus kit, núm de catálogo D4068 y D4069 siguiendo las instrucciones del fabricante. Para realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se utilizó un termociclador miniPCR y cebadores diseñados a partir de la secuencia de referencia del NCBI NC_051829.1 (ROS_Cfam_1.0), de acuerdo con las especificaciones del Manual de usos y procedimientos de laboratorio Oncogenes CDMX R. La mezcla de reacción contenía ADN a una concentración de 6 ng/µL, cebadores a 10 µM, dNTP a 2 mM, Taq polimerasa a 5 U/µL, solución amortiguadora 10×, MgCl₂ a 30 mM y BSA 100×.

La PCR se llevó a cabo en un volumen final de 20 µL, con las siguientes condiciones de amplificación: un ciclo de desnaturalización inicial a 94 °C durante 3 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, alineamiento durante 30 s con gradiente de temperatura y extensión a 72 °C; y un ciclo de extensión final a 72 °C durante 3 min. Para el alineamiento, se utilizó un gradiente de temperatura de 66.7 a 67.8 °C.

Resultados

Se realizó un estudio histopatológico de las muestras analizadas, con el resultado: “proliferación linfoide compatible con posible enteritis linfoplasmocitaria severa, sin descartar linfoma intestinal de bajo grado” (fig. 3).

Figura 3. Imagen histopatológica de proliferación linfoide intestinal (imagen de referencia).

Los resultados de la biopsia en este caso fueron no concluyentes, por lo que se decidió realizar PCR PARR para diferenciar entre ambas enfermedades. En el cuadro 1 se presentan los parámetros para interpretar de esta prueba.

ResultadoSignificadoFenotipoInterpretación
Positivo/ClonalTodas las células provienen de una sola célula mutada. Hay una población de linfocitos idénticosCélulas BSugerente a neoplasias linfoidesPronóstico ligeramente más favorable, responde mejor a la quimioterapia
Células TMuy sugerente de neoplasias linfoides; no responde muy bien a la quimioterapia; pronóstico más agresivo
NegativoMuchos linfocitos diferentes, cada uno con su reordenamiento únicoPuede haber mezcla entre B y TSugestivo de un proceso inflamatorio reactivo
Oligoclonal o seudoclonalPocos clones“Zona gris”Linfoma en etapa tempranaMuestra de mala calidad
No amplificaMuestra no diagnóstica debido a mala calidad del ADN

Cuadro 1. Interpretación de PCR PARR.

Se realizó una PCR para el análisis de reordenamientos de los receptores de antígeno (PARR), cuyo resultado fue negativo para reordenamiento clonal. Esto ayuda a descartar la presencia de neoplasia linfoide y confirmar el diagnóstico de enfermedad intestinal inflamatoria.

Discusión

Debido a que ambos procesos comparten numerosas características clínicas, ultrasonográficas e histopatológicas, los métodos diagnósticos convencionales para diferenciar entre enfermedad intestinal inflamatoria y linfoma gastrointestinal pueden resultar insuficientes. Como en el presente caso clínico, la incorporación del PCR PARR, como herramienta complementaria, permite descartar la presencia de clonalidad en la muestra. En este contexto, la prueba PCR PARR constituye una herramienta valiosa que complementa y permite diferenciar un proceso reactivo de uno neoplásico, aumentando la posibilidad de llegar a un diagnóstico certero y preciso y de ofrecer un tratamiento adecuado para cada enfermedad. Además, dada la notable similitud entre ambas patologías, no se puede descartar que algunos casos diagnosticados como neoplasias linfoides correspondan, en realidad, a procesos inflamatorios, por lo que pruebas como el PCR PARR ayudan a esclarecer el diagnóstico.

Otro aspecto práctico que debe considerarse es la posibilidad de que los tutores se nieguen a autorizar procedimientos bajo anestesia general por temor a complicaciones o, en algunos casos, debido a que el paciente presenta otras enfermedades que podrían aumentar el riesgo anestésico, lo que convierte a la PCR a partir de una muestra de sangre en una alternativa útil y poco invasiva. Por otro lado, los autores coinciden con lo descrito por Withrow et al., quienes señalan que la calidad del ADN es un factor crítico para obtener resultados confiables en las pruebas de clonalidad y que el método de extracción a partir de sangre completa es una buena opción para obtener ADN de calidad. Aunque algunos autores, como Meza et al., han reportado resultados satisfactorios con muestras fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE), el proceso de fijación y almacenamiento puede ocasionar la fragmentación de los ácidos nucleicos, disminuir la eficiencia de la amplificación y comprometer la interpretación diagnóstica.7

Conclusiones

La PCR-PARR constituye una herramienta molecular valiosa para resolver la ambigüedad diagnóstica entre las neoplasias linfoides y los procesos inflamatorios, especialmente cuando los métodos convencionales no son concluyentes. Además, permite identificar el tipo celular involucrado y aportar información pronóstica sobre la evolución de la enfermedad y su posible respuesta al tratamiento.

Referencias

  1. Harvey A, Tasker S, editors. Manual de medicina felina. 1.ª ed. Barcelona: Ediciones S; 2014. 
  2. Hall EJ, Simpson JW, Williams DA, editors. Manual de gastroenterología en pequeños animales. 2.ª ed. Barcelona: Ediciones S; 2008. 
  3. Vail DM, Thamm DH, Liptak JM. Withrow y MacEwen. Oncología clínica de pequeños animales. 6.ª ed. Madrid: Edra; 2022. p. 455. 
  4. Murphy K, Weaver C. Janeway’s immunobiology. 9th ed. New York: Garland Science; 2016. 
  5. Schatz DG, Swanson PC. V(D)J recombination: mechanisms of initiation. Annu Rev Genet. 2011;45:167-202. doi: 10.1146/annurev-genet-110410-132552. 
  6. Little AJ, Matthews AGW, Oettinger MA. The mechanism of V(D)J recombination. In: Alt FW, Honjo T, Radbruch A, Reth M, editors. Molecular biology of B cells. 2nd ed. London: Academic Press; 2015. p. 13-34. doi: 10.1016/B978-0-12-397933-9.00002-3. 
  7. Meza G, Ulloa JC, Uribe AM, Gutiérrez MF. Técnica no convencional de extracción de ADN a partir de tejido embebido en parafina para uso en la reacción en cadena de la polimerasa. Rev U.D.C.A Actual Divulg Cient. 2013;16(1):35-41.
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